吳 歡 銅仁市檢驗(yàn)檢測(cè)院 554300

　　摘要:本文研究了固相萃取濃縮凈化—?dú)庀嗌V檢測(cè)法(GC)測(cè)定乳與乳制飲品中 C18H34O2(游離脂肪酸)含量。樣品利用石油醚·乙醚萃取法(第一法)及叔丁基甲醚·正己烷萃取法(第二法)兩種前處理方法進(jìn)行脂肪酸的提取,固相萃取柱進(jìn)一步凈化,使用氫氧化鉀甲醇酯化,應(yīng)用氣相色譜法 - 氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)測(cè)定。

　　結(jié)果顯示,在 0.01mg/mL ~ 0.04mg/mL 濃度范圍內(nèi),峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系,r > 0.999。在 0.005、0.01、0.02mg/mL 添加水平,第一法樣品平均回收率為 87.20% ~ 107.10%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.22 ~ 4.00, 第二法樣品平均回收率為 85.6% ~ 97.1%, 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.38 ~ 5.00,回收率比第一法略低。研究表明,二種方法均適用于乳制飲品中游離脂肪酸的測(cè)定,具有快速、定量準(zhǔn)確、檢測(cè)靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

　　關(guān)鍵詞:乳制飲品;脂肪酸;測(cè)定方法;對(duì)比

　　1. 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

　　1.1.1 儀器和設(shè)備

　　氣相色譜儀(配有 FID 檢測(cè)器),Agilent Technologies;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 RE-52AA,上海亞榮生化儀器廠;電熱恒溫水浴鍋,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;自動(dòng)快速濃縮儀 DSY- II 型,北京金科精華苑技術(shù)研究所。

　　1.1.2 試劑

　　冰醋酸、石油醚、乙醇、無(wú)水硫酸鈉、乙醚、石油醚、氯化鈉、氫氧化鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);正己烷、三 氟化硼甲醇、二氯甲烷、異丙醇、叔丁基甲醚、甲醇(美國(guó) TEDIA 科技公司)。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)操作與步驟

　　1.2.1 提取樣品脂肪制備

　　(1) 石油醚·C4H10O 提取脂肪法

　　牛奶、 酸牛奶等液態(tài)試樣:稱取10g(精確到0.1mg)試樣于抽脂管中,待測(cè)。

　　奶酪、奶粉固態(tài)試樣:稱取試樣 1.0g(精確到 0.1 mg)至抽脂管中,加入 65±1°C的水 10 mL 溶解試樣,振搖,使樣品完全分散。

　　于上述試樣中加入 2 mL 氨水,于 65±1°C水浴鍋中放置15min,取出輕搖,冷卻至室溫。 在制備好的樣品中加入10mLC2H6O,混勻。加入 25 mLC4H10O,加塞振搖 1min。加 入 25mL 石油醚,加塞振搖 1min,靜置、分層,有機(jī)層轉(zhuǎn)入磨口燒瓶中。再加入 25mLC4H10O 及 25mL 石油醚,加塞振搖 1min,靜置、分層,有機(jī)層轉(zhuǎn)入磨口燒瓶中,再重復(fù)操作一次。合并抽提液于磨口燒瓶中,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。

　　(2) 叔丁基甲醚·正己烷提取脂肪法

　　牛奶、酸牛奶等液體樣品,稱取 10g( 精確到 0.01mg) 置于 50mL 的離心管中,加入 10mLC2H6O、1mLH2SO4(2.5mol/L)。

　　奶酪:稱取 1g(精確到 0.01mg) 奶酪,用無(wú)水 Na2SO4 進(jìn)行碾碎,加入 0.3mLH2SO4(2.5mol/L)。

　　奶粉:稱取 1g(精確到 0.01 mg)奶粉,加入 65±1°C 的 水 10mL 溶解試樣, 振搖, 使樣品完全分散,加入10mLC2H6O、1mL H2SO4(2.5mol/L)。

　　1.2.2 分析步驟

　　(1)濃縮

　　在 60°C水浴情況下,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干,接著在 60°C下氮?dú)獯蹈伞?/span>

　　(2)游離 C18H34O2 的收集

　　過(guò)氨基柱

　　活化:加入 3ml 二氯甲烷·異丙醇 (2:1) 和3mL 叔丁基甲醚·正己烷(1:1)使柱子活化。

　　上樣:在樣品中加入 3mL 叔丁基甲醚·正己烷(1:1)( 重復(fù)3次 )震蕩,將樣品溶于其中,吸入柱內(nèi)。

　　洗脫:加入6mL 二氯甲烷·異丙醇 (2:1)(重復(fù)2次)洗脫結(jié)合態(tài)的 C18H34O2。

　　收集:用 2% 醋酸叔丁基甲醚 3mL 進(jìn)行洗脫(重復(fù)2次),用圓底磨口燒瓶進(jìn)行收集,使游離 C18H34O2 洗脫出。

　　將其用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)干。

　　(3)皂化酯化

　　濃縮干燥之后再加入 10 mL 氫氧化鉀甲醇溶液置于 80±1°C水浴上回流 10 min。再加入 5 mL 三氟化硼甲醇溶液,繼續(xù)回流 15min,冷卻至室溫。

　　(4)進(jìn)樣

　　拿出后靜置冷卻后,倒入 50mL 離心管中,以飽和氯化鈉溶液洗凈瓶?jī)?nèi)殘留物,每次 3mL,一共洗四次。用移液管吸取 10mL 正己烷進(jìn)入離心管中,蓋上管蓋,混勻,以 5000 轉(zhuǎn) / 分鐘的速度,離心 5 分鐘。離心完畢后,取上層有機(jī)相 2mL 進(jìn)進(jìn)樣瓶,待氣相色譜用。

　　1.2.3 儀器參數(shù)與測(cè)定條件

　　色譜條件:

　　色譜柱:SP-2560(聚二氰丙基硅氧烷強(qiáng)極性固定),柱長(zhǎng) 100m,內(nèi)徑 0.25mm,膜厚 0.20μm。

　　載氣:氮?dú)狻?載氣流速:1.0 mL/min。

　　進(jìn)樣口溫度:260°C。分流比:30:1。

　　檢測(cè)器溫度:280°C。

　　柱溫箱溫度:初始溫度 140°C,保持 5min,以 4°C /min 升溫至 240°C,保持 15min。

　　1.2.4 氣相定性定量分析

　　外標(biāo)法定量。根據(jù)樣液中被測(cè)游離 C18H34O2 含量情況,選定濃度相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測(cè)液中游離C18H34O2 的響應(yīng)值在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測(cè)液等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰值直接比較計(jì)算樣品含量。

　　試樣中游離 C18H34O2 的含量按公式(1)計(jì)算

　　式中:

　　As —試樣溶液中游離 C18H34O2 的峰面積;

　　Astd—標(biāo)準(zhǔn)工作液中游離 C18H34O2 的峰面積;

　　Cstd—標(biāo)準(zhǔn)工作液中游離 C18H34O2 的濃度,單位為微克 每毫升(mg/mL);

　　V —溶解試樣或濃縮后所定容的體積,單位為毫升(mL); m —試樣的稱樣量,單位為克(g);

　　f —校正因子。

　　1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　由于牛乳中豆蔻酸、棕櫚酸及硬脂酸的含量分別為 8%~ 14%,22% ~35%,9%~ 14%,3 種 C18H34O2 可占到 C18H34O2 總量的 60%以上。

　　以正己烷為溶劑,配成肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)含量分別為 0.010、0.015、0.020、0.0275、0.04mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列, 在規(guī)定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。在優(yōu)化的 GC 分析條件下進(jìn)樣 20μL,按公式(2)進(jìn)行計(jì)算,并以樣品濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　按式 (1) 計(jì)算工作曲線的回歸方程:

　　Y=m·C+b (2)

　　式中:

　　Y -C18H34O2 的峰面積; C -C18H34O2 濃度,mg/mL; m - 線性回歸方程斜率。b - 線性回歸方程截距; 1.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)取各樣品均為 10g,按照優(yōu)化的 GC 分析條件進(jìn)行測(cè)定,同一天重復(fù)進(jìn)樣 6 次,記錄峰面積值,并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì) 標(biāo)準(zhǔn)偏差,考察其重現(xiàn)性。

　　1.2.7回收率實(shí)驗(yàn)

　　為了評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度,本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品分別進(jìn)行了0.005、0.01、0.02mg3 個(gè)濃度的肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)加標(biāo)回收,加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),每種樣品取四份,一份作為樣品本底,其余加入標(biāo)準(zhǔn)工作液不同濃度后,按樣品前處理方法處理后進(jìn)樣 20μL,以測(cè)得的峰面積比計(jì)算平均回收率。

　　2. 結(jié)果與討論

　　2.1 前處理方法的選擇

　　2.1.1 提取劑的選擇

　　采用石油醚·C4H10O 提取法及叔丁基甲醚正己烷提取法。對(duì)于第一種方法是由氨水—C2H6O 破壞脂類和非脂成分的結(jié)合,再用石油醚 C H O 進(jìn)行提取。

　　C4H10O 的沸點(diǎn)低,C4H10O 溶解脂肪的能力比石油醚強(qiáng)?，F(xiàn)有的脂肪含量的標(biāo)準(zhǔn)分析法都采用 C4H10O 做提取劑。但 C4H10O 約可飽和 2% 的水分,含水的 C4H10O 也將同時(shí)抽出糖分等非脂類成分,所以,實(shí)用時(shí)必需采用無(wú)水 C4H10O 做提取劑,被測(cè)樣品必須事先烘干。石油醚具有較高的沸點(diǎn),它沒(méi)有膠溶現(xiàn)象,不會(huì)夾帶膠態(tài)的淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)。石油醚抽出物比較接近真實(shí)的脂類。

　　而第二種方法是有硫酸—C2H6O 破壞脂類和非脂成分的結(jié)合,再用叔丁基甲醚·正己烷進(jìn)行提取。由于樣品中的乳類脂肪中的脂肪球被乳中酪蛋白鈣包裹,又處于高度分散的膠體分散系中,故不能直接被提取劑提取 ,需先用堿或酸處理后再進(jìn)行提取。

　　2.1.2 凈化方法的選擇

　　在收集游離 C18H34O2 時(shí),本文采用了過(guò)氨基小柱 (NH2), 它具有極性固定相和弱陰離子交換劑,可通過(guò)弱陰離子交換 ( 水溶液 ) 或極性吸附 ( 非極性有機(jī)溶液 ) 達(dá)到保留作用,所以適用于水溶液樣品中碳水化合物弱陰子和有機(jī)酸化合物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),此種方法其溶劑使用量少、操作簡(jiǎn)單、且能很好的將游離 C18H34O2 洗脫出。

　　2.2 檢出限和線性范圍

　　通過(guò)數(shù)據(jù)總體看來(lái),在回收率上,第一種方法對(duì)于棕櫚酸(C16:0)及硬脂酸(C18:0)效果比較理想,平均要比第二種方法上高出 5 ~ 10% 左右,通過(guò)石油醚 C4H10O 的連續(xù)萃取,是 C18H34O2 能很好的被提取,第二種方法的測(cè)定,對(duì)于肉豆蔻酸(C14:0)的回收率較為理想可穩(wěn)定于 90% 左右,二種方法的回收率及 RSD 均符合游離 C18H34O2 的檢測(cè)要求及方法的建立。

　　2.3 兩種前處理法對(duì)于不同乳制飲品進(jìn)行游離 C18H34O2 含量測(cè)定

　　從市場(chǎng)上銷售的乳制飲品中挑選了四種常見(jiàn)的品種(牛奶、酸牛奶、奶酪、奶粉),通過(guò)對(duì)四種不同的乳制飲品進(jìn)行檢測(cè)其游離 C18H34O2,從中來(lái)探討不同乳制飲品中游離 C18H34O2 的含量及組成成分以及兩種方法測(cè)出的結(jié)果。

　　2.3.1 石油醚·C4H10O 提取脂肪法

　　將四種不同的乳制飲品,通過(guò)第一種方法進(jìn)行前處理,凈化及甲酯化,最后用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn),四種不同的乳制飲品中,其中奶酪的游離 C18H34O2 為最多有 105.13 mg/100g,其次為奶粉和牛奶,酸奶中游離 C18H34O2 為最少僅有 1.78mg/100g。

　　一般液態(tài)奶的脂肪含量在 3 ~ 5%,奶粉的的脂肪含量不得低于 26% 以及奶酪的脂肪含量不得低于 25%,而酸奶中的 脂肪含量為 0.5 ~ 1.2% 左右。

　　由于在工藝上,酸奶通過(guò)發(fā)酵后,降解了一些脂肪和蛋白質(zhì)的作用,乳酸菌發(fā)酵乳糖生成乳酸菌時(shí),引起pH下降,延長(zhǎng)了產(chǎn)品的保存時(shí)間。

　　奶粉通過(guò)噴霧干燥之后,采用二級(jí)均質(zhì)法,能很好的降低游離 C18H34O2 含量。

　　奶酪是以蛋白質(zhì)和脂肪為主要成分含有少量無(wú)機(jī)鹽、乳糖、維生素等的乳制飲品。100 份原料乳大致只能生成10份 奶酪,即等于將原料中的主要成分蛋白質(zhì)和脂肪濃縮了 10 倍。通過(guò)長(zhǎng)期的發(fā)酵也會(huì)產(chǎn)生更多的游離C18H34O2。

　　牛奶樣品中游離 C18H34O2 組成成分及占比分別是:肉豆蔻酸(C14:0)7%、棕櫚酸(C16:0)47%、硬脂酸(C18:0)19%、其 它 27%。

　　酸牛奶樣品中游離 C18H34O2 組成成分及占比分別是:肉豆蔻酸(C14:0)4%、棕櫚酸(C16:0)30%、硬脂酸 (C18:0)10%、其它 56%。

　　奶酪樣品中游離 C18H34O2 組成成分及占比分別是:肉豆蔻酸 (C14:0)5%、棕櫚酸(C16:0)36%、硬脂酸(C18:0)16%、其它43%。

　　奶粉樣品中游離 C18H34O2 組成成分及占比分別是肉豆蔻酸 (C14:0)4%、棕櫚酸(C16:0)41%、硬脂酸(C18:0)14%、其它 41%。

　　由以上數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在各種游離 C18H34O2 占有比例上,其中棕櫚酸(C16:0)為最多可占總游離 C18H34O2 總量的 40 ~ 60%,其次為硬脂酸(C18:0)可占 10 ~ 20% 左右,相比較而言,肉豆蔻酸(C14:0)所含的量為最低,只占 6 ~ 10%。

　　其棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、豆蔻酸(C14:0)三者的總含量可達(dá)總游離脂肪總量的 50~90%,可以說(shuō)在乳制飲 品中的游離 C18H34O2,其三者占有很大比例。

　　同時(shí)可以看出,在牛奶中游離脂肪的種類并不多,其中,棕櫚酸(C16:0)、 硬脂酸(C18:0)、豆蔻酸(C14:0) 三者為主要成分。

　　當(dāng)然,也可能由于本身牛乳中豆蔻酸、棕櫚酸及硬脂酸的含量分別為 8%~ 14%,22%~ 35%,9%~ 14%,3 種 C18H34O2 可占到 C18H34O2 總量的 60%以上。所以,在游離 C18H34O2 中其三者的量也占了大部分。

　　奶酪與牛奶色譜圖相比,多了 C18:1N9C(油酸)和 C18:2N6C( 亞油酸 ),各游離酸明顯增多。

　　2.3.2 叔丁基甲醚·正己烷提取脂肪法將四種不同的乳制飲品,通過(guò)第二種方法進(jìn)行前處理,凈化及甲酯化,最后用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果可見(jiàn)表 1。 此次的方法所測(cè)得的結(jié)果整體上略小于石油醚 C4H10O提取法的結(jié)果。

　　利用二種前處理方法測(cè)定同種品牌的同種商品,相比較而言,采用石油醚·C4H10O 提取的樣品中測(cè)出的數(shù)據(jù)略大于叔丁基甲醚·正己烷提取法的數(shù)據(jù),基本上差距在 10% ~ 20% 左右。

　　從表 3 中也可發(fā)現(xiàn),四種乳制飲品其游離 C18H34O2 含量從低到高有明顯的不同,在兩種方法的結(jié)果比較中也可看出第一種方法對(duì)于牛奶、酸奶、奶酪和奶粉測(cè)定中游離 C18H34O2 都明顯高于第二法,所以,無(wú)論是在游離 C18H34O2 多或少的樣品中,第一法的結(jié)果都略顯高于第二法。

　　第一種方法采用氨水—C2H6O 溶液破壞乳的膠體性及脂肪球膜,使非脂成分溶解于氨水—C2H6O 溶液中,而脂肪游離出來(lái),再用 C4H10O—石油醚提取出脂肪,效率比較高,而第二種方法利用硫酸—C2H6O 溶液進(jìn)行水解,隨后用叔丁基甲醚·正己烷通過(guò)幾次離心進(jìn)行萃取。

　　在第一種方法中用石油醚 C4H10O 連續(xù)幾次萃取并用通過(guò)震蕩法采取提取,通過(guò)連續(xù)幾次的提取后,能更好的將脂肪溶解在石油醚 C4H10O 中,并且在實(shí)驗(yàn)操作中,因?yàn)镃4H10O 溶解脂肪的能力比石油醚強(qiáng),所以在第一次提取時(shí),先放 C4H10O 在放石油醚能達(dá)到更好的效果。

　　3. 結(jié)論

　　本文研究了含有游離脂肪酸的乳與乳制品的前處理方法,采用石油醚·乙醚提取法及叔丁基甲醚·正己烷提取法。石油醚·乙醚提取法(第一法)是由氨水—乙醇破壞脂類和非脂成分的結(jié)合,再用石油醚·乙醚進(jìn)行提取。而叔丁基甲醚·正己烷提取法(第二法)是由硫酸—乙醇破壞脂類和非脂成分的結(jié)合,再用叔丁基甲醚·正己烷進(jìn)行提取。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),第一法比第二法提取的游離脂肪酸更多。

　　在對(duì)兩種前處理方法進(jìn)行線性及回收率測(cè)的實(shí)驗(yàn)中可得出 : 在 0.01mg/mL-0.04mg/mL 濃度范圍內(nèi),峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系,r>0.999。在 0.005、0.01、0.02 mg/mL 添加水平,第一法樣品平均回收率為 87.20%-107.10%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.22-4.00,第二法樣品平均回收率為 85.6%- 97.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.38-5.00,回收率比第一法略低。

　　綜上所述,二種方法均適用于乳制品中游離脂肪酸的測(cè)定,具有快速、定量準(zhǔn)確、檢測(cè)靈敏等優(yōu)點(diǎn),相比較而言,石油醚·乙醚提取法的回收率略高。

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