蘇茹月 1 黃容 2 吳燕雨 2 張娟(通訊作者)2* 河南省疾病預(yù)防控制中心,河南 鄭州 450016; 2. 南華大學(xué)藥學(xué)院,湖南 衡陽 421001

　　作者簡介:蘇茹月(1992 年 6 月 -),女,河南商丘,碩士。研究方向:粟酒裂殖酵母線粒體功能的研究。

　　基金項目:湖南省教育廳科學(xué)研究項目(項目編號:19C1578)

　　摘要:多蛋白復(fù)合體(MPCS)是蛋白質(zhì)在體內(nèi)行使功能的重要形式之一。藍色溫和非變形聚丙烯凝膠(BN-PAGE)是一種依賴于考馬斯亮藍 G250 染料給蛋白質(zhì)帶上負電荷的非變性蛋白的分離方法,是研究蛋白質(zhì)復(fù)合體最強有力的方法之一。本文運用 BN-PAGE 技術(shù)來研究粟酒裂殖酵母線粒體蛋白復(fù)合體,利用 BN-PAGE 和 western blot 方法技術(shù)相結(jié)合對粟酒裂殖酵母線粒體蛋白復(fù)合體進行鑒定。本次研究選擇粟酒裂殖酵母線粒體蛋白 Ppr10 作為研究對 象,實驗結(jié)果表明,粟酒裂殖酵母線粒體蛋白 Ppr10 的缺失影響了線粒體復(fù)合體及超復(fù)合體的組裝。

　　關(guān)鍵詞:粟酒裂殖酵母;線粒體;多蛋白復(fù)合體;BN-PAGE;Ppr10

　　前言

　　本研究通過借鑒在芽殖酵母或哺乳動物中的 BN-PAGE 實驗方法來摸索適用于粟酒裂殖酵母中的條件,進而探討粟酒裂殖酵母中 Ppr10 蛋白的缺失是否影響線粒體呼吸鏈復(fù)合體及超復(fù)合體的組裝導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能受損,這為更好地研究粟酒裂殖酵母線粒體蛋白功能提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料與儀器

　　粟酒裂殖酵母野生型菌株 yHL6381,以及本實驗室構(gòu)建突變體菌株 Δppr10 保存在 -80°C冰箱,Bis-Tris,三甲基甘氨酸,Serva Blue G-250,6- 氨基己酸,甘氨酸,去垢劑十二萬基麥芽糖甘和洋地黃皂苷,抗體購自南京金斯瑞 , 過硫酸銨購自上海生工,實 驗用水來自 Milli-Q 純水系統(tǒng),ECL PLUS 顯色液,超速離心機,梯度混合儀,小轉(zhuǎn)子,蠕動泵。

　　1.2 方法

　　1.2.1 線粒體蛋白制備

　　挑取活化好的野生型菌株yHL6381,以及突變株 Δppr10,接種在 YES 液體培養(yǎng)基中 30 °C振蕩培養(yǎng),離心收菌。超純水洗菌一次,接著用 S buffer 緩沖液洗滌一次,加入溶菌裂解酶裂解酵母細胞壁 ,4°C離心收菌,加入菌體 4 倍體積的勻漿緩沖液吹打混勻,然后將菌液轉(zhuǎn)移到 Dounce 勻漿器中,將 Dounce勻漿器置于冰中 ,d o u n c e 1 5 - 2 0 次 ,離心 取上清 ,4 ° C ,1 2 0 0 0 g ,離心 30 min,棄上清,保留沉淀,將沉淀溶解在 SEM buffer 中,即為線粒體蛋白提取液,保存于 -80°C冰箱 [1]。

　　1.2.2 非變性梯度膠制備

　　用梯度混合儀分別灌制 3% ~ 12% 和 5% ~ 10% 的分離膠,室溫冷卻 1-1.5h,待分離膠凝固之后再灌制 4% 的濃縮膠,放 30°C 30 min 使凝膠充分膠聯(lián)。

　　1.2.3 線粒體蛋白處理

　　取yHL6381,Δppr10菌株線粒體蛋白粗提取液,4°C 12000rpm 離心 15min,并用 1mg/mL 的 3×Gel buffer 重懸,并添 加終濃度為 1mM PMSF 和 5mM MgCl2,再次 4°C 15300g 離心 30min, 棄上清,添加終濃度為 2% 的去垢劑,充分混勻,并放置在 4°C 30 min。4°C,15300g 離心 5min,將得到的上清取出 3uL 用來測濃度。將離心得到的上清放在 -80°C保存,上清添加 BN sample buffer 使終濃度為 0.25%。

　　1.2.4 上樣

　　取 120ug 樣品加入 2uL BN sample buffe 充分混勻后上樣。

　　1.2.5 電泳

　　將處理好的樣品用微量注射器加入上樣孔中,倒入 1× 陰 極緩沖液 A;鹽酸調(diào)整溶液 PH=7.0,添加 0.02% 和陽極緩沖 液,4°C,恒壓 80V 開始電泳,待電泳進行到凝膠的 1/3 處時將陰極緩沖液 A 更換成陰極緩沖液 B,將電壓調(diào)整到 150V,整個電泳過程電流控制在 50 mA 左右,電泳過程中應(yīng)避免產(chǎn)生較多 的熱量。

　　1.2.6 BN-PAGE 考馬斯亮藍染色

　　BN-PAGE 凝膠電泳結(jié)束后,一方面可用于考馬斯亮藍染色,另一方面可用于westernblot。取出BN-PAGE凝膠,加入考馬斯亮藍染色液,緩慢震蕩染色 30 min,回收考馬斯亮藍染液,加入脫色液洗滌到膠棉呈現(xiàn)清晰的條帶為止,拍照。

　　1.2.7 BN-PAGE western blot

　　取出 BN -PAGE 凝膠,放入轉(zhuǎn)膜緩沖液。轉(zhuǎn)膜的條件為 150mA,90min,冰上進行。洗膜,倒入封閉液,20 rpm 封閉 1.5-2h。洗膜,敷一抗。在一抗孵育快結(jié)束時配制化學(xué)二抗,按 1:2000 加入化學(xué)二抗,20 rpm,室溫孵育1h。洗膜,將膜放在化 學(xué)發(fā)光儀器,曝光顯色。

　　2 結(jié)果

　　2.1 芽殖酵母和裂殖酵母復(fù)合體 III/IV 亞基組成分析

　　線粒體氧化磷酸化需要通過鑲嵌在線粒體內(nèi)膜的 5 個復(fù)合體來進行,即復(fù)合體 I,復(fù)合體 II,復(fù)合體 III,復(fù)合體 IV,復(fù)合體 V,這五個復(fù)合體在人類細胞中非常保守。在芽殖酵母中沒有復(fù)合體 I,而是有 3 個 NADH 脫氫酶取代。而在粟酒裂殖酵母卻是相對保守,只有復(fù)合體 III,復(fù)合體 IV,復(fù)合體 V。這些復(fù)合體之間也可以形成超級復(fù)合體比如III2+IV2,III2+IV1 或 Vn,又或者是這些復(fù)合體之間會形成二聚體III2 或 IV2。裂殖酵母復(fù)合體 III 預(yù)測相對分子量為 219.34kDa,復(fù)合體 IV 預(yù)測相對分子量為 219.61kDa,這些只是預(yù)估復(fù)合體相對分子量大小,但是實際上要比預(yù)估的分子量大,這些分子量有助于分析超復(fù)合體的組成。

　　2.2 不同去垢劑對 BN-PAGE 實驗結(jié)果的影響

　　分別用 DG 和 DM 處理粟酒裂殖酵母線粒體樣品會得到不同的蛋白復(fù)合體。參照芽殖酵母中超復(fù)合體蛋白的亞基大小,對粟酒裂殖酵母中超復(fù)合體蛋白進行初步的標記,DG 處理粟酒裂殖酵母線粒體會得到 2 個超復(fù)合體,而 DM 處理粟酒裂殖酵母線粒體會得到超復(fù)合體 III。不同的去垢劑處理線粒體會得到不同復(fù)合體。

　　2.3 Western blotting 檢測 DG 處理 Δppr10 線粒體后的 結(jié)果

　　對比野生型菌株 yHL6381,用 Cox1 抗體檢測時,發(fā)現(xiàn) Δppr10 菌株中的超復(fù)合體 III2+IV 和復(fù)合體 IV 顯著降低;用 Atp9 抗體檢測時,復(fù)合體 V 出現(xiàn)較大的降低,而復(fù)合體 Vn 降低不明顯;用 Cob1 抗體檢測時,超復(fù)合體 III2+IV1 急劇降低,超復(fù)合體 III2 也出現(xiàn)顯著降低。以上結(jié)果表明,Ppr10 蛋白的缺失對線粒體超復(fù)合體 III2+IV/IV/V/III2+IV1/III2 的組裝有嚴重的影響,對復(fù)合體 Vn 的組裝有輕微的影響。

　　2.4 Western blotting 檢測 DM 處理 Δppr10 線粒體后的結(jié)果

　　在梯度膠5%-10%電泳,對比野生型菌株yHL6381,用 Cox1 抗體檢測時,發(fā)現(xiàn) Δppr10 菌株中的復(fù)合體 IV 顯著降低;用 Atp9 抗體檢測時,復(fù)合體 V 出現(xiàn)較大的降低;用 Cob1 抗體檢測時,復(fù)合體 III 出現(xiàn)顯著降低。上述結(jié)果表明,Ppr10 蛋白的缺失對線粒體復(fù)合體 III/IV/V 的組裝有嚴重的影響。

　　3 討論

　　本文主要通過 complexIII 的亞基 Cob1 進行抗體檢測復(fù)合體組裝,根據(jù)考馬斯亮藍條帶染色結(jié)果表明,不同濃度梯度膠以及不同去垢劑的處理都會影響電泳結(jié)果,因此我們要選用合適的去垢劑濃度從而分離得到不同分子質(zhì)量大小的復(fù)合體。實驗結(jié)果表明去垢劑的濃度在 2% 有利于保護復(fù)合體的穩(wěn)定性。另外,用不同的去垢劑處理線粒體蛋白,會得到不同的蛋白超復(fù)合體。BN- PAGE 方法在研究蛋白質(zhì)相互作用中具有很大的優(yōu)點,但是在線粒體蛋白樣品提取以及電泳分離純化等方面需要不斷優(yōu)化 [2-3],且 在粟酒裂殖酵母中應(yīng)用較少,本研究為 BN-PAGE 在研究粟酒裂殖酵母線粒體蛋白復(fù)合體及超復(fù)合體奠定了基礎(chǔ)。

　　本研究能夠證明粟酒裂殖酵母中 Ppr10 對線粒體蛋白復(fù)合體的組裝很重要。發(fā)現(xiàn) Ppr10 蛋白的缺失會影響線粒體蛋白會嚴重影響復(fù)合體 III/IV/V 和超復(fù)合體 III2+IV/IV/V/III2+IV1/III2 的組裝,對復(fù)合體 Vn 的組裝影響較小。本研究闡明了 Ppr10 是通過影響線粒體復(fù)合體的組裝來影響線粒體蛋白的翻譯和合成受損,進而導(dǎo)致 Ppr10 敲除菌在非發(fā)酵培養(yǎng)基上表現(xiàn)出生長缺陷的表型。因此,本文對研究 Ppr10 在粟酒裂殖酵母中的功能具有重要的意義。

　　Ppr10 有兩個模體,并且模體的缺失會導(dǎo)致粟酒裂殖酵母菌株出現(xiàn)線粒體呼吸缺陷表型。因此,接下來可以進一步研究 Ppr10 蛋白的兩個模體會在線粒體蛋白復(fù)合體的組裝中發(fā)揮的作用。

　　參考文獻:

　　[1] 李琴 . 粟酒裂殖酵母 Ppr10-Mpa1 復(fù)合體的制備 [D]. 南京師范大學(xué) ,2019.

　　[2] 張娟 . 粟酒裂殖酵母中 ppr 基因缺失引起細胞絮凝的機制研究 [J]. 微生物學(xué)雜志 ,2019,39(02):11-17.

　　[3] 閆建華 . 粟酒裂殖酵母中 PPR 蛋白 Ppr10 與 Mpa1 相互作用的研究 [D]. 南京師范大學(xué) ,2016.