張彥斌 靳志敏 王巖 閆彩霞 張宏博通訊作者 內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心 呼和浩特 010090

　　第一作者:張彥斌(1983—),男,內(nèi)蒙古呼和浩特市,微生物檢驗(yàn)師(中級(jí)),碩士,研究方向:食品質(zhì)量與安全。

　　通信作者:張宏博,男,(1986—),內(nèi)蒙古巴彥淖爾市,高級(jí)工程師,博士,研究方向:食品質(zhì)量與安全。

　　基金項(xiàng)目:內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(xiàng)(ZDZX2016016);內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)獎(jiǎng)勵(lì)資金項(xiàng)目(2017 年度);內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導(dǎo)獎(jiǎng)勵(lì)資金 項(xiàng)目(KCBJ2018068)。

　　摘 要:對(duì)豆制品運(yùn)用改良CTAB法、SDS法提取DNA,能夠優(yōu)化大豆及豆制品的檢測(cè)。本文選擇小黃豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐幾種樣品,運(yùn)用改良CTAB法、SDS-PVP法、SDS法、CTAB法、TIANGEN試劑盒法分別提取DNA純度。結(jié)果顯示,提取大豆DNA運(yùn)用改良CTAB法、SDS法提取出質(zhì)量較好的DNA,純度較高,豆腐樣品中的DNA濃度最 低,研究改良CTAB法、SDS法運(yùn)用下的PCR產(chǎn)物凝膠電泳,得出擴(kuò)增正常的模板DNA,顯示提取的DNA未被污染,純度較高。改良CTAB法、SDS法可得出DNA條帶。對(duì)小黃豆、大豆 MON 89788、豆腐運(yùn)用SDS法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻玫礁鼮榍逦幕蚪MDNA條帶,完整性更強(qiáng)。SDS法檢測(cè)適用性較強(qiáng),較為便捷,可用于大豆及豆制品的實(shí)際檢測(cè)活動(dòng)。

　　關(guān)鍵詞:大豆 MON 89788;轉(zhuǎn)基因檢測(cè);SDS法;改良CTAB法

　　引言

　　目前我國(guó)民眾對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的生態(tài)安全性、食用安全性依然存在一定爭(zhēng)議,部分國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因食品要求標(biāo)簽化管理。在 此背景下,運(yùn)用準(zhǔn)確、快速的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方式,可以保證消費(fèi)者對(duì)大豆相關(guān)食品的選擇權(quán)與知情權(quán)。

　　1. 豆制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中不同 DNA 提取方法的比較實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　1.1 材料與試劑

　　本次研究選擇從家樂(lè)福超市購(gòu)買的豆腐、小黃豆、大豆油,轉(zhuǎn)基因大豆品種選擇從美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì) AOAC 購(gòu)得 MON 89788 大豆。

　　研究試液選擇上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)的磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)、0.5Mol/l8.0pH 酸堿度的乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液、pH 酸堿度 8.0 的 CTAB 提取緩沖液、SDS 提取 / 裂解緩沖液、改良 CTAB 提取緩沖液,選擇北京 TIANGEN 生物公司生產(chǎn)的 TIANGEN 試劑盒,選擇碧云天生物技術(shù)公司生產(chǎn)的 RNA 酶 A、蛋白酶 K[1]。

　　1.2 設(shè)備與儀器

　　選擇美國(guó) BIO - RAD 公司生產(chǎn)的 T100TMPCR 儀,美國(guó) THERMO 公司生產(chǎn)的高速冷凍離心機(jī),常州國(guó)華電器有限公司生產(chǎn)的 SHA - B 恒溫振蕩器,日本島津公司生產(chǎn)的 UV - 1800 紫外分光光度計(jì),上海天能公司生產(chǎn)的 TANON 6600 凝膠成像儀,上海安亭公司生產(chǎn)的 TGl - 16G 高速離心機(jī),常州國(guó)華電器有限公司生產(chǎn)的 HH - 4 數(shù)顯恒溫水浴鍋。

　　1.3 DNA 提取方法

　　農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 1485 號(hào)公告- 4 - 2010 中的相關(guān)規(guī)定,運(yùn)用改良 CTAB 法、SDS - PVP 法、SDS 法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的提取與純化。按照相應(yīng)方法中的要求配置抽提緩沖液,結(jié)合 TIANGEN 試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求配置相關(guān)溶液,將提取到的 DNA 放入冰箱,冷藏保存,以便于后續(xù)檢測(cè)運(yùn)用。見(jiàn)表 1。

　　2. 豆制品轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中不同 DNA 提取方法的比較結(jié)果與分析

　　2.1 研究蛋白酶 K、RNA 酶 A 的濃度

　　蛋白酶 K 能夠幫助釋放大豆及豆制品中的 DNA,能夠有效消化包圍靶 DNA 含有的蛋白質(zhì),因此實(shí)驗(yàn)中可以適當(dāng)增加蛋白酶 K 濃度。?蛋白酶 K 的濃度與 DNA 純度之間有一定聯(lián)系,在 5MG/Ml 蛋白酶 K 濃度或者不添加蛋白酶 K 情況下,得 出的 D260NM/D280NM 值往往低于 1.7,顯示大豆中蛋白質(zhì)污染嚴(yán)重。蛋白酶 K 濃度逐漸提升時(shí),D260NM/D280NM 值逐漸接近 1.8。在蛋白酶 K 濃度高于 20MG/Ml 之后,D260NM/ D280NM 值會(huì)再次低于 1.7,又出現(xiàn)了蛋白質(zhì)污染現(xiàn)象。這主要是由于蛋白酶 K 本身也屬于蛋白質(zhì),加入濃度過(guò)高會(huì)造成蛋白質(zhì)污染。由此本次實(shí)驗(yàn)中蛋白酶 K 濃度?設(shè)置為 15MG/ Ml。在提取 DNA 時(shí),若出現(xiàn) RNA 污染,會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成不良 影響。而 RNA 酶 A 則能夠水解 RNA,由此本次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了 RNA 酶 A 的添加濃度的添加 [2]。

　　在 RNA 酶 A 濃度小于等于 4MG/Ml,或者不添加 RNA 酶 A 情況下,得出的 D260NM/D280NM 值往往低于 1.9,顯示 大豆中 RNA 污染嚴(yán)重。RNA 酶 A 濃度逐漸提升時(shí),D260NM/ D280NM值逐漸接近1.9。設(shè)置8MG/MlRNA酶A濃度,在 RNA酶A濃度逐漸提升時(shí),D260NM/D280NM值能夠趨于較為穩(wěn)定,由此本次研究運(yùn)用RNA酶A濃度設(shè)置為8MG/ Ml。見(jiàn)圖 1。

　　2.2 研究并鑒定 5 種方法提取樣品的 DNA 純度、濃度

　　對(duì)小黃豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐分別運(yùn)用改良 CTAB 法、SDS - PVP 法、SDS 法、CTAB 法、TIANGEN 試 劑盒法等提取 DNA 純度。在 D260NM/D280NM 低于 1.7 時(shí),說(shuō)明出現(xiàn)蛋白質(zhì)污染。在 D260NM/D280NM 值大于等于 1.9 情 況下,可見(jiàn)存在 RNA 污染,在 D260NM/D280NM 數(shù)值保持在 1.8 上下時(shí),得出的 DNA 純度較高 [3]。

　　對(duì)于小黃豆樣品、大豆 MON 89788 樣品運(yùn)用改良 CTAB 法、SDS 法提取的 DNA,具有 1.7-1.9D260NM/D280NM 值?？?見(jiàn),在提取大豆 DNA 時(shí),運(yùn)用改良 CTAB 法、SDS 法能夠提取出質(zhì)量較好的 DNA,純度較高。豆腐在加工過(guò)程中需要進(jìn)行一定的熱處理,為深加工產(chǎn)品,加工中會(huì)產(chǎn)生一些不同的物質(zhì),由此使得 DNA 出現(xiàn)一定的降解。因此本文五種方法運(yùn)用過(guò)程中,提取的 DNA 純度數(shù)值均呈現(xiàn)一定程度的降低。SDS 法運(yùn)用下 DNAD260NM/D280NM 值得到 1.8 ?,運(yùn)用其他方法時(shí),得到的 D260NM/D280NM 值在 1.7 上下。依據(jù)此分析結(jié)果,可知五種方法中,SDS 法能夠得到最好的提取效果。大豆油的生產(chǎn)需要經(jīng)歷一定的精煉過(guò)程,會(huì)在一定程度上損失 DNA,增加了提取難度,由此可運(yùn)用改良 CTAB 法提取大豆油中的 DNA。

　　分析幾種研究方法下對(duì)小黃豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐的 DNA 提取濃度,綜合分析可知效果最佳的為 SDS法,效果最不理想的為 SDS - PVP 法。其重要原因?yàn)?SDS 屬于 陰離子去污劑,在高溫的實(shí)驗(yàn)條件下,能夠裂解細(xì)胞,離析染色 體,并使得蛋白變性。并且? SDS 會(huì)和多糖、蛋白質(zhì)等合成復(fù)合 物,提升 DNA 得率,并釋放核酸。實(shí)驗(yàn)中為了得到濃度更高的 DNA,可以適當(dāng)增加鹽溶液濃度、抽提酚溶液與三氯甲烷。

　　實(shí)驗(yàn)中添加的 PVP 屬于一種高分子表面活性劑,運(yùn)用中提升了提取反應(yīng)體系黏稠性,能夠吸附研究樣品中的部分 DNA,降低 DNA含量。幾種樣品在運(yùn)用不同研究方法下,與小黃豆樣品、大豆MON89788樣品相比,豆腐樣品中的DNA濃度最低。其原因之一為豆腐加工過(guò)程中在一定程度上破壞了DNA。

　　2.3 豆制品轉(zhuǎn)基因瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

　　實(shí)驗(yàn)中,要求驗(yàn)證大豆 lECTIN 基因研究提取的 DNA 與后續(xù) PCR 檢測(cè)工作的契合度。對(duì)幾種研究方法下的不同樣品的 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,分析蛋白質(zhì)中蘊(yùn)含的多糖、蛋白質(zhì)、RNA 情況,雜質(zhì)的出現(xiàn)會(huì)阻礙 PCR 反應(yīng),導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)。分析改 良 CTAB 法、SDS 法運(yùn)用下的 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳情況,得出擴(kuò) 增正常的模板DNA,顯示提取的DNA未被污染,得出較高的純度。

　　比較不同樣品下的 DNA,最終的 DNA 條帶具有 118BP 條 帶大小。與最終研究產(chǎn)物的片段大小保持一致。由此可見(jiàn),可以 使用改良 CTAB 法、SDS 法提取 DNA。研究改良 CTAB 法、SDS 法下樣品 DNA 完整性凝膠電泳情況,可見(jiàn),改良 CTAB 法、SDS 法運(yùn)用下均能夠得出 DNA 條帶。與改良 CTAB 法相比,對(duì)小黃豆、大豆 MON 89788、豆腐運(yùn)用 SDS 法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻玫礁鼮?清晰的基因組 DNA 條帶,完整性更強(qiáng)。對(duì)大豆油的 DNA 提取效果不佳,由此得到的基因組DNA條帶不夠完整,清晰度不高。出現(xiàn)少量的蛋白質(zhì)污染,綜合以上可知最佳的施行方法為 SDS 法。

　　3. 結(jié)果分析

　　實(shí)驗(yàn)研究表明,可通過(guò)改良CTAB法、SDS法得出 DNA 條帶。與改良 CTAB 法相比,對(duì)小黃豆、大豆 MON 89788、豆腐運(yùn)用 SDS 法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虻玫礁鼮榍逦幕蚪M DNA 條帶,完整性更強(qiáng)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)最佳的施行方法為 SDS 法。在具體操作過(guò)程中,簡(jiǎn)化操作步驟,減少對(duì)基因組 的損傷,降低污染可能性。本次研究應(yīng)用價(jià)值較大。

　　參考文獻(xiàn):

　　[1]趙冰兵,任雯,周秒依,等.葉片直接PCR法在玉米轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)中的應(yīng) 用[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2019,47(04):11-14.

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　　[3]鄒奕,朱尚明,栗媛,等.樣品不同處理方法提取甜菜基因組DNA的比對(duì)研究[C]//中國(guó)作物學(xué)會(huì)甜菜專業(yè)