摘要：本文實驗中建立了一種用QuEChERS前處理，用UPLC-MS/MS測定水產(chǎn)中硝基呋喃代謝物的測定方法。結果表明：在0.5～10.0ng/mL范圍內線性關系良好，r均大于0.995；加標回收率范圍在83.2%～108.9%，相對標準偏差（RSD）在2.2%～8.4%。實驗證明該方法具有過程簡單、靈敏度高、回收率好等優(yōu)點，可為水產(chǎn)中硝基呋喃代謝物的快速檢測提供方法依據(jù)。

　　引言

　　硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基呋喃結構的廣譜抗菌藥物，具有廣譜抗菌作用，被廣泛應用于醫(yī)藥、畜牧及水產(chǎn)養(yǎng)殖中防治細菌感染疾病。[1]但該類藥物半衰期很短，在動物體內能迅速代謝，而與蛋白結合的代謝物在生物體內能長期穩(wěn)定殘留，并具有潛在的致畸、致癌和誘導機體產(chǎn)生突變的作用。[2]中華人民共和國農業(yè)農村部公告第250號將硝基呋喃列入《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》。

　　硝基呋喃類藥物主要包括呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮，它們代謝物分別是5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-內酰脲（AHD）和3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ），這些代謝產(chǎn)物和蛋白質結合比較穩(wěn)定，能在生物組織中存留較長時間，故利用代謝物的檢測可以反映硝基呋喃藥物的殘留狀況。[3]

　　畜禽及水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測方法主要有免疫膠體金法、液相色譜法和液質聯(lián)用法等。監(jiān)測動物性食品中殘留的硝基呋喃類代謝物，目前最常用液質聯(lián)用法，其前處理步驟相對簡單、雜質干擾少，能夠比較準確地對硝基呋喃類代謝物進行定性和定量分析。[4]

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器與設備

　　Waters Xevo TQ-S Micro三重四級桿質譜儀（配有Acquity UPLC超高效液相色譜儀及電噴霧離子源，美國Waters公司），SIGMA高速冷凍離心機（美國SIGMA公司）；Milli Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；IKA刀式研磨儀、IKA旋轉蒸發(fā)儀、渦旋振蕩器（均為美國IKA）。

　　1.2 材料與試劑

　　AMOZ、SEM、AHD、AOZ及其同位素內標D5-AMOZ、13C15N-SEM、13C3-AHD、D4-AOZ的對照品（純度≥98%，A ChemTek, Inc和北京曼哈格公司）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純，默克公司）；2-硝基苯甲醛（純度99%，aladdin公司）；鹽酸、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、二甲亞砜（均為分析純）。

　　1.3 實驗方法

　　1.3.1 標準溶液配制

　　分別準確稱取硝基呋喃類代謝物標準品，用甲醇稀釋，制備混合基質標準校準溶液使最終樣液中四種硝基呋喃代謝物的濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0，10.0ng/mL，同時加入四種硝基呋喃代謝物內標物（100ng/mL）100uL。

　　1.3.2 樣品前處理

　　水解及衍生魚肉組織先經(jīng)研磨儀絞碎并使之均勻化，稱取2g試樣于50mL塑料離心管中，加入硝基呋喃代謝物內標物（100ng/mL）100uL，再加入0.2mol/L鹽酸8mL，衍生劑0.05mol/L衍生劑0.5mL，混勻，渦旋1min，置于37℃恒溫水浴振蕩（避光）16h。

　　凈化：將經(jīng)水解、衍生后的樣品溶液取出后，加入0.5mol/L磷酸氫二鉀溶液1mL，用2.0mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH7.0～7.5，再加入10mL乙腈，加入QuEChERS萃取鹽包，渦旋1min，使其充分混合，8000r/min離心5min，取離心后的上清液6mL加入QuEChERS凈化管中，渦旋1min，8000r/min離心5min，取上清液5mL，在40℃條件下旋蒸至近干，用20%乙腈溶液復溶殘渣并定容至1mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，上機。

　　1.3.3 儀器條件

　　（1）色譜條件

　　色譜柱：Waters Acquity BEH C 18（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫：35℃；流速：0.2mL/min；進樣量10μL；流動相：A相為乙腈，B相為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序0～3.00min，20%～50%A；3.00～6.00min，50%A；6.01～8.00min，20%A。

　　（2）質譜條件

　　離子化模式：電噴霧離子源ESI，正離子模式；多反應監(jiān)測（MRM）檢測模式；毛細管電壓1.0kV；脫溶劑氣溫度350℃；脫溶劑氣流量650L/min。

　　結果與分析

　　2.1 標準曲線配制的確定

　　四種硝基呋喃代謝物的分子量均在75～201g/mol之間，離子化效率較低，所以必須在酸性條件下進行衍生，標準曲線的制定也要按照樣品前處理的步驟，進行衍生。

　　2.2 質譜條件的確定

　　將濃度為 300ng/mL 的硝基呋喃類藥物以流動注射的方式，在正離子模式下對質譜參數(shù)毛細管電壓、錐孔電壓以及碰撞能量等進行調諧優(yōu)化。四種硝基呋喃代謝物和內標衍生物多反應監(jiān)測質譜參數(shù)優(yōu)化結果如圖1所示。

圖 1 四種硝基呋喃代謝物和內標衍生物的質譜分析參數(shù)（* 表示定量離子）

　　2.3 方法學驗證

　　2.3.1 方法的線性范圍及檢出限

　　本實驗采用溶劑加標制備混合標準溶液的方式，按上述前處理方法，向5個離心管中分別加入適量四種硝基呋喃混合標準溶液，使最終樣液中四種硝基呋喃代謝物的濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0，10.0ng/mL，同時加入四種硝基呋喃代謝物內標物（100ng/mL）100uL，以混合標準溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標制，建立標準工作曲線。結果表明，四種硝基呋喃代謝物在0.5～10.0ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數(shù)r均在0.995以上(圖2)。以3倍信噪比（S/N>3）計算檢出限為0.1μg/kg，以10倍信噪比（S/N>10）計算定量限為0.25μg/kg。

圖 2 四種硝基呋喃代謝物的標準曲線及相關系數(shù)表

　　2.3.2 回收率和精密度

　　選取陰性魚肉，按照前處理方法，分別添加不同量的混合標準溶液（添加水平分別為0.5、1.25、2.5μg/kg），每個濃度設6個平行樣，分別計算回收率和精密度，來驗證方法的準確性，結果表明四種硝基呋喃代謝物的平均回收率在83.2%～108.9%，相對標準偏差（RSD）在2.2%～8.4%。實驗結果見圖3。

　　3 結語

　　本實驗采用衍生、QuEChERS 前處理，超高效液相色譜—串聯(lián)質譜技術，建立了水產(chǎn)品中四種硝基呋喃代謝物殘留的檢測方法。結果表明，該前處理方法快速方便，大大減少了試劑用量。本方法線性、回收率、精密度均滿足檢測要求，可用于水產(chǎn)品質量安全監(jiān)測時大批量樣品中硝基呋喃代謝物的快速篩查。（珠海市食品藥品檢驗所　彭蕓）

參考文獻：

[1]辛少平、鄧建朝、楊賢慶等。高效液相色譜法測定硝基呋喃類藥物代謝物及其在對蝦體內的代謝[J]。食品科學，2014,35(24)：151-157。

[2]邢麗紅、孫偉紅、彭吉星等。液相色譜-串聯(lián)質譜法測定貝類組織中硝基呋喃類代謝物殘留量[J]。環(huán)境化學，2019,38(02)：287-296。

[3]唐紅梅、曾芳、李成洪。食品中硝基呋喃類藥物及其代謝物殘留檢測的研究進展[J]。食品安全質量檢測學報，2016,7(10)：3952-3959。

[4]趙東豪、黎智廣、王旭峰等。高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的優(yōu)化研究[J]。南方水產(chǎn)科學，2015,11(06)：58-64。