張彥斌 靳志敏 王巖 閆彩霞 張宏博通訊作者 內蒙古自治區(qū)食品檢驗檢測中心 呼和浩特 010090

　　第一作者:張彥斌(1983—),男,內蒙古呼和浩特市,微生物檢驗師(中級),碩士,研究方向:食品質量與安全。

　　通信作者:張宏博,男,(1986—),內蒙古巴彥淖爾市,高級工程師,博士,研究方向:食品質量與安全。

　　基金項目:內蒙古自治區(qū)科技重大專項(ZDZX2016016);內蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導獎勵資金項目(2017 年度);內蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新引導獎勵資金 項目(KCBJ2018068)。

　　摘 要:對豆制品運用改良CTAB法、SDS法提取DNA,能夠優(yōu)化大豆及豆制品的檢測。本文選擇小黃豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐幾種樣品,運用改良CTAB法、SDS-PVP法、SDS法、CTAB法、TIANGEN試劑盒法分別提取DNA純度。結果顯示,提取大豆DNA運用改良CTAB法、SDS法提取出質量較好的DNA,純度較高,豆腐樣品中的DNA濃度最 低,研究改良CTAB法、SDS法運用下的PCR產物凝膠電泳,得出擴增正常的模板DNA,顯示提取的DNA未被污染,純度較高。改良CTAB法、SDS法可得出DNA條帶。對小黃豆、大豆 MON 89788、豆腐運用SDS法進行實驗能夠得到更為清晰的基因組DNA條帶,完整性更強。SDS法檢測適用性較強,較為便捷,可用于大豆及豆制品的實際檢測活動。

　　關鍵詞:大豆 MON 89788;轉基因檢測;SDS法;改良CTAB法

　　引言

　　目前我國民眾對轉基因食品的生態(tài)安全性、食用安全性依然存在一定爭議,部分國家對轉基因食品要求標簽化管理。在 此背景下,運用準確、快速的轉基因檢測方式,可以保證消費者對大豆相關食品的選擇權與知情權。

　　1. 豆制品轉基因檢測中不同 DNA 提取方法的比較實驗設計

　　1.1 材料與試劑

　　本次研究選擇從家樂福超市購買的豆腐、小黃豆、大豆油,轉基因大豆品種選擇從美國分析化學家協(xié)會 AOAC 購得 MON 89788 大豆。

　　研究試液選擇上海生工生物工程股份有限公司生產的磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)、0.5Mol/l8.0pH 酸堿度的乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液、pH 酸堿度 8.0 的 CTAB 提取緩沖液、SDS 提取 / 裂解緩沖液、改良 CTAB 提取緩沖液,選擇北京 TIANGEN 生物公司生產的 TIANGEN 試劑盒,選擇碧云天生物技術公司生產的 RNA 酶 A、蛋白酶 K[1]。

　　1.2 設備與儀器

　　選擇美國 BIO - RAD 公司生產的 T100TMPCR 儀,美國 THERMO 公司生產的高速冷凍離心機,常州國華電器有限公司生產的 SHA - B 恒溫振蕩器,日本島津公司生產的 UV - 1800 紫外分光光度計,上海天能公司生產的 TANON 6600 凝膠成像儀,上海安亭公司生產的 TGl - 16G 高速離心機,常州國華電器有限公司生產的 HH - 4 數(shù)顯恒溫水浴鍋。

　　1.3 DNA 提取方法

　　農業(yè)農村部 1485 號公告- 4 - 2010 中的相關規(guī)定,運用改良 CTAB 法、SDS - PVP 法、SDS 法進行轉基因植物的提取與純化。按照相應方法中的要求配置抽提緩沖液,結合 TIANGEN 試劑盒說明書的要求配置相關溶液,將提取到的 DNA 放入冰箱,冷藏保存,以便于后續(xù)檢測運用。見表 1。

　　2. 豆制品轉基因檢測中不同 DNA 提取方法的比較結果與分析

　　2.1 研究蛋白酶 K、RNA 酶 A 的濃度

　　蛋白酶 K 能夠幫助釋放大豆及豆制品中的 DNA,能夠有效消化包圍靶 DNA 含有的蛋白質,因此實驗中可以適當增加蛋白酶 K 濃度。?蛋白酶 K 的濃度與 DNA 純度之間有一定聯(lián)系,在 5MG/Ml 蛋白酶 K 濃度或者不添加蛋白酶 K 情況下,得 出的 D260NM/D280NM 值往往低于 1.7,顯示大豆中蛋白質污染嚴重。蛋白酶 K 濃度逐漸提升時,D260NM/D280NM 值逐漸接近 1.8。在蛋白酶 K 濃度高于 20MG/Ml 之后,D260NM/ D280NM 值會再次低于 1.7,又出現(xiàn)了蛋白質污染現(xiàn)象。這主要是由于蛋白酶 K 本身也屬于蛋白質,加入濃度過高會造成蛋白質污染。由此本次實驗中蛋白酶 K 濃度?設置為 15MG/ Ml。在提取 DNA 時,若出現(xiàn) RNA 污染,會對實驗造成不良 影響。而 RNA 酶 A 則能夠水解 RNA,由此本次實驗優(yōu)化了 RNA 酶 A 的添加濃度的添加 [2]。

　　在 RNA 酶 A 濃度小于等于 4MG/Ml,或者不添加 RNA 酶 A 情況下,得出的 D260NM/D280NM 值往往低于 1.9,顯示 大豆中 RNA 污染嚴重。RNA 酶 A 濃度逐漸提升時,D260NM/ D280NM值逐漸接近1.9。設置8MG/MlRNA酶A濃度,在 RNA酶A濃度逐漸提升時,D260NM/D280NM值能夠趨于較為穩(wěn)定,由此本次研究運用RNA酶A濃度設置為8MG/ Ml。見圖 1。

　　2.2 研究并鑒定 5 種方法提取樣品的 DNA 純度、濃度

　　對小黃豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐分別運用改良 CTAB 法、SDS - PVP 法、SDS 法、CTAB 法、TIANGEN 試 劑盒法等提取 DNA 純度。在 D260NM/D280NM 低于 1.7 時,說明出現(xiàn)蛋白質污染。在 D260NM/D280NM 值大于等于 1.9 情 況下,可見存在 RNA 污染,在 D260NM/D280NM 數(shù)值保持在 1.8 上下時,得出的 DNA 純度較高 [3]。

　　對于小黃豆樣品、大豆 MON 89788 樣品運用改良 CTAB 法、SDS 法提取的 DNA,具有 1.7-1.9D260NM/D280NM 值?？?見,在提取大豆 DNA 時,運用改良 CTAB 法、SDS 法能夠提取出質量較好的 DNA,純度較高。豆腐在加工過程中需要進行一定的熱處理,為深加工產品,加工中會產生一些不同的物質,由此使得 DNA 出現(xiàn)一定的降解。因此本文五種方法運用過程中,提取的 DNA 純度數(shù)值均呈現(xiàn)一定程度的降低。SDS 法運用下 DNAD260NM/D280NM 值得到 1.8 ?,運用其他方法時,得到的 D260NM/D280NM 值在 1.7 上下。依據(jù)此分析結果,可知五種方法中,SDS 法能夠得到最好的提取效果。大豆油的生產需要經歷一定的精煉過程,會在一定程度上損失 DNA,增加了提取難度,由此可運用改良 CTAB 法提取大豆油中的 DNA。

　　分析幾種研究方法下對小黃豆、大豆油、大豆 MON 89788、豆腐的 DNA 提取濃度,綜合分析可知效果最佳的為 SDS法,效果最不理想的為 SDS - PVP 法。其重要原因為 SDS 屬于 陰離子去污劑,在高溫的實驗條件下,能夠裂解細胞,離析染色 體,并使得蛋白變性。并且? SDS 會和多糖、蛋白質等合成復合 物,提升 DNA 得率,并釋放核酸。實驗中為了得到濃度更高的 DNA,可以適當增加鹽溶液濃度、抽提酚溶液與三氯甲烷。

　　實驗中添加的 PVP 屬于一種高分子表面活性劑,運用中提升了提取反應體系黏稠性,能夠吸附研究樣品中的部分 DNA,降低 DNA含量。幾種樣品在運用不同研究方法下,與小黃豆樣品、大豆MON89788樣品相比,豆腐樣品中的DNA濃度最低。其原因之一為豆腐加工過程中在一定程度上破壞了DNA。

　　2.3 豆制品轉基因瓊脂糖凝膠電泳檢測

　　實驗中,要求驗證大豆 lECTIN 基因研究提取的 DNA 與后續(xù) PCR 檢測工作的契合度。對幾種研究方法下的不同樣品的 DNA 進行 PCR 擴增,分析蛋白質中蘊含的多糖、蛋白質、RNA 情況,雜質的出現(xiàn)會阻礙 PCR 反應,導致假陰性結果出現(xiàn)。分析改 良 CTAB 法、SDS 法運用下的 PCR 產物凝膠電泳情況,得出擴 增正常的模板DNA,顯示提取的DNA未被污染,得出較高的純度。

　　比較不同樣品下的 DNA,最終的 DNA 條帶具有 118BP 條 帶大小。與最終研究產物的片段大小保持一致。由此可見,可以 使用改良 CTAB 法、SDS 法提取 DNA。研究改良 CTAB 法、SDS 法下樣品 DNA 完整性凝膠電泳情況,可見,改良 CTAB 法、SDS 法運用下均能夠得出 DNA 條帶。與改良 CTAB 法相比,對小黃豆、大豆 MON 89788、豆腐運用 SDS 法進行實驗能夠得到更為 清晰的基因組 DNA 條帶,完整性更強。對大豆油的 DNA 提取效果不佳,由此得到的基因組DNA條帶不夠完整,清晰度不高。出現(xiàn)少量的蛋白質污染,綜合以上可知最佳的施行方法為 SDS 法。

　　3. 結果分析

　　實驗研究表明,可通過改良CTAB法、SDS法得出 DNA 條帶。與改良 CTAB 法相比,對小黃豆、大豆 MON 89788、豆腐運用 SDS 法進行實驗能夠得到更為清晰的基因組 DNA 條帶,完整性更強。瓊脂糖凝膠電泳檢測最佳的施行方法為 SDS 法。在具體操作過程中,簡化操作步驟,減少對基因組 的損傷,降低污染可能性。本次研究應用價值較大。

　　參考文獻:

　　[1]趙冰兵,任雯,周秒依,等.葉片直接PCR法在玉米轉基因快速檢測中的應 用[J].山西農業(yè)科學,2019,47(04):11-14.

　　[2]張鴻凱,楊曼,石登紅,等.不同DNA提取方法在獼猴桃屬植物中的應用 [J].貴陽學院學報(自然科學版),2018,013(001):101-104.

　　[3]鄒奕,朱尚明,栗媛,等.樣品不同處理方法提取甜菜基因組DNA的比對研究[C]//中國作物學會甜菜專業(yè)